| Peter Parker / Spider-Man | 安德鲁·加菲尔德
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| Gwen Stacy | 艾玛·斯通
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| Dr. Curt Connors / The Lizard | 瑞斯·伊凡斯
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| Ben Parker | 马丁·辛
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| Mary Parker | 艾伯丝·戴维兹
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| May Parker | 莎莉·菲尔德
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| Flash Thompson | 克里斯·泽尔卡
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| George Stacy | 丹尼斯·利瑞
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| Ray | C·托马斯·豪威尔
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| Mrs. Van Adder | 安妮·帕里西
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| Richard Parker | 坎贝尔·斯科特
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| Sally Avril | 凯尔西·周 | |
| Stan the Librarian | 斯坦·李
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| Nels Van Adder / Proto-Goblin | 伊尔凡·可汗
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| Ariel | 安珀·史蒂芬斯
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| David Lowell | 迈克尔·马西
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| Missy Kallenback | 汉娜·马克斯
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| Howard Stacy | 斯凯勒·吉桑多
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| Miss Ritter | 芭芭拉·伊芙·哈里斯
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| Peter Parker - age 7 | 麦克斯·查尔斯
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| Helen Stacy | 卡丽·科尔曼
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| Billy Connors | 迈尔斯·艾略特
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| Oscorp Intern (as Hannah Pitts) | 汉娜·劳埃德
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| Angelo Fincelli | 帕特里克·艾伦·戴维斯
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| Glasses | 雷夫·甘特沃特
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| Philip Stacy | 查理·德皮尤
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| Lab Tech #2 | 艾瑞克·斯尔沃
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| Sharisse | Andrea Sixtos
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| Jack | 杰克·凯弗
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| Simon Stacy | 雅各布·罗迪尔
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| Tina | 莫利·摩根
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| SWAT Officer (uncredited) | 亚历山大·贝特里
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| Scientist (uncredited) | 马克斯·博格纳
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| Customs House Pedestrian (uncredited) | 蒂娜·柏德
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| Freckled Kid (uncredited) | 马克·多尔蒂
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| Scientist (uncredited) | 肯·爱德林
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| Lab Technician (uncredited) | 杰佛瑞·福克斯
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| Tough Guy #4 - Subway (uncredited) | 拜伦·弗莱迪
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| Construction Worker (uncredited) | Shashawnee Hall | |
